Metode pengukuran terhadap sel telah banyak mengalami perkembangan. Begitu pula dengan instrumen yang digunakan. Berikut ini adalah informasi mengenai perkembangan instrumentasi flow cytometry.

https://www.hpi-hamburg.de/

Pengukuran keluaran utama flow cytometry

Terdapat tiga pengukuran keluaran utama dari flow cytometry, yaitu hamburan ke depan, hamburan samping, dan sinyal fluoresen. Cahaya tampak laser memantul dari setiap sel yang memberikan karakteristik ukuran dan bentuk umum sel.

Forward scatter (FSC)

FSC merupakan hamburan yang datang dari arah depan dan mencerminkan ukuran sel. Hamburan diukur di sepanjang jalur laser dan setiap sel akan membelokkan cahaya di sekitar sisi sel yang menyebabkan difraksi. Oleh karena itu, intensitas FSC mencerminkan diameter sel.

Side scatter (SSC)

SSC atau hamburan samping merupakan hamburan diukur pada 90 derajat dari sinar laser dan mencerminkan granularity atau kompleksitas sel.

Struktur di dalam sel akan mengubah arah gelombang cahaya yang masuk ke dalam sel sehingga struktur seluler tertentu, seperti granula dan nukleus, akan membiaskan cahaya. Semakin intens SSC, semakin banyak refraksi, semakin banyak granularitas yang diharapkan dalam sel.

Sinyal fluoresen

Ukuran keluaran ketiga adalah sinyal fluoresen. Ini adalah cahaya yang dipancarkan ketika laser menggairahkan fluorofor. Fluorofor adalah molekul yang dapat menyerap dan memancarkan kembali cahaya pada saat eksitasi.

Foton dari sumber sinar laser diserap oleh elektron fluorofor, memindahkannya ke tingkat energi yang lebih tinggi. Elektron ini kemudian melepaskan energi sebagai foton untuk kembali ke keadaan dasarnya. Panjang gelombang foton ini dipengaruhi oleh jumlah energi yang hilang dari interaksi molekuler selama proses tersebut.

Setiap fluorofor memiliki spektrum emisi sendiri yang sebagian mungkin tumpang tindih dengan fluorofor lainnya. Fluorofor dapat digunakan untuk memberi label antibodi yang pada gilirannya dapat mengikat dan dengan demikian mendeteksi antigen spesifik pada atau di dalam sel atau dapat digunakan sebagai pewarna untuk mewarnai sel secara langsung, misalnya dengan mengikat DNA.

Alat yang digunakan dalam flow cytometry

Minimal cytometer akan berisi laser, detektor, dan sistem fluidics untuk memastikan aliran cepat sel melewati sinar laser. Jumlah laser dalam sitometer dan jumlah serta kualitas detektor telah meningkat secara signifikan selama bertahun-tahun. Perkembangan ini telah memperluas jumlah penanda yang dapat dideteksi sekaligus.

Flow cytometers dapat dirancang untuk tujuan tertentu. Misalnya, untuk memungkinkan throughput sampel yang tinggi dan pemuat pelat sumur dapat digabungkan untuk memungkinkan analisis lepas tangan yang cepat dari beberapa sampel. Berikut ini adalah perkembangan instrumentasi flow cytometry.

Sitometri massa (spektrometri massa waktu penerbangan atau cyTOF)

Alih-alih antibodi yang diberi label dengan fluorofor, teknik ini menggunakan antibodi yang diberi label dengan tag ion logam berat. Lebih dari 100 probe logam tersedia dengan tumpang tindih sinyal yang terbatas, memungkinkan analisis dimensi yang lebih tinggi daripada flow cytometry tradisional.

Oleh karena itu, fenotip mendalam dapat dilakukan dengan teknik ini, yang berguna dalam bidang penelitian seperti imunologi dan kanker.

Perbedaan utama dengan flow cytometry tradisional adalah bahwa tetesan yang mengandung sel untuk analisis diuapkan, diatomisasi, dan diionisasi dalam ruang aliran, dan spektrometer massa mendeteksi ion yang dihasilkan. Waktu penerbangan ion dari sampel ke detektor digunakan untuk analisis.

Sitometri aliran spectral

Daripada menilai emisi puncak setiap fluorofor, sitometri aliran spektral menggunakan serangkaian detektor untuk mengukur seluruh spektrum setiap fluorofor. Spektrum ini kemudian dipisahkan menggunakan algoritma.

Hal ini memungkinkan penggunaan fluorofor dengan spektrum yang tumpang tindih untuk meningkatkan jumlah parameter yang dianalisis dalam satu percobaan.

Imaging cytometry

Jenis sitometri ini menggabungkan aliran tradisional dengan mikroskop fluoresensi. Teknik tambahan memungkinkan untuk penilaian morfologi sel dan dapat digunakan untuk memvisualisasikan ko-ekspresi protein, pengikatan sel, translokasi inti protein dan sinapsis sel imun.

Penyortiran sel

Penyortir sel yang diaktifkan fluoresensi atau fluorescence-activated cell sorter (FACS) adalah perangkat yang menggunakan flow cytometry dalam menyortir sel untuk analisis atau eksperimen lebih lanjut.

Alih-alih hanya mengukur karakteristik sel, sel-sel dipilih berdasarkan karakteristik tertentu dan dipandu ke dalam bejana pengumpul untuk memurnikan sampel untuk jenis sel tertentu. Contoh penggunaan FACS adalah untuk mendapatkan sel T dari sampel sel mononuklear darah perifer (PBMC) dari darah.

Karena pembiakan sel lebih lanjut sering diperlukan setelah penyortiran, penyortiran penting dilakukan dalam kondisi steril dan prosedurnya lembut untuk menghindari kerusakan sel dan mengurangi viabilitasnya.

Itulah informasi mengenai perkembangan instrumentasi flow cytometry. Anda bisa mendapatkan instrument pengukuran flow cytometry di Syaf Unica Indonesia.

 

WEBSITE || SYAF.CO.ID